Выделение чистых культур на жидких средах

Методы высева на чашки дают обычно удовлетворительные результаты при выделении бактерий и грибов, так как подавляющее большинство этих организмов хорошо растет на твердых средах. Однако пока не удается успешно культивировать на твердых средах некоторые виды бактерий с более крупными клетками; многие простейшие и водоросли также могут расти только в жидкой среде. Хотя в последние годы для выделения вирусов применяются методы высева из чашки, многие вирусы гораздо легче выделить, используя жидкие среды. Конечно, здесь никогда не получают чистой культуры, так как вирусы — облигатные внутриклеточные паразиты. В этом случае цель заключается в получении двухкомпонентной культуры, состоящей из определенного вируса и его биологического хозяина.

Наиболее простой способ получения чистых культур в жидких средах — это метод разведений. Инокулят последовательно разводят стерильной средой и аликвотами из каждого разведения засевают большое число пробирок со средой. Цель этой операции — инокулировать ряд пробирок настолько разведенной взвесью микробов , чтобы вероятность внести в данную пробирку даже одну особь была достаточно малой (порядка 0,05) . Если таким разведенным инокулятом засевается много пробирок, то по теории вероятности можно вычислить, что в 95% всех засеянных пробирок не попадет ни одной клетки. По одной особи попадает в 4,8% пробирок, по две — в 0,12% пробирок, а в 0,002% всех засеянных пробирок окажется по три особи. Поэтому, если 6 пробирке что-то выросло, то, скорее всего, этот рост обусловлен попаданием в нее всего лишь одного организма. Вероятность этого составляет 0,048/(0,048 + 0,0012 + 0,00002) = 0,975.

Вероятность того, что рост вызван попаданием в пробирку лишь одного организма, очень быстро падает с увеличением среднего числа организмов (клеток) в инокуляте. Поэтому важно, чтобы выделение производилось из той серии пробирок, где в подавляющем большинстве случаев вообще не обнаруживается роста.

Метод разведений, однако, имеет один существенный недостаток. Его можно использовать для выделения только тех организмов, которые численно преобладают в смешанной популяции микробов. Им нельзя с успехом пользоваться для выделения более крупных микроорганизмов, неспособных развиваться на твердой среде (например, простейших или водорослей), так как в природных популяциях бактерии, как правило, сильно превосходят их по численности. Это ограничивает применимость метода разведений.

Если нельзя использовать ни метод разведений, ни метод высева на чашки, то остается только одно — прибегнуть к контролируемому под микроскопом выделению из смешанной популяции отдельной клетки или организма. Такая процедура называется выделением отдельной клетки. Техническая трудность ее обратно пропорциональна размерам выделяемого организма. Этот метод относительно прост, если микроорганизм обладает крупными клетками, например, при работе с водорослями или простейшими, но пользоваться им для выделения бактерий гораздо сложнее.

В случае крупных микроорганизмов нужно захватить отдельный индивидуум в тонкую капиллярную пипетку, а затем промыть его несколько раз в относительно больших объемах стерильной среды, чтобы удалить примесь мелких микробов. Эти операции производят вручную, контролируя их визуально при относительно небольшом увеличении, например, используя препаровальную лупу.

Если выделяемый организм столь мал, что его трудно рассмотреть при увеличении менее 100, то применять капилляр уже нельзя, так как при больших увеличениях невозможно достаточно тонко манипулировать им вручную. В этом случае пользуются особым механическим устройством — микроманипулятором и специально изготовленными очень тонкими стеклянными инструментами. Назначение микроманипулятора состоит в том, чтобы уменьшить амплитуду движений, производимых вручную; это позволяет в небольшом рабочем пространстве (микрокапле) при постоянном наблюдении в микроскоп (х500—1000) осуществлять очень малые и точно контролируемые перемещения инструментов.

Двухкомпонентные культуры

Обычно цель выделения — получить чистую культуру. Иногда, однако, это сделать невозможно или настолько трудно, что практически не имеет смысла. В этих случаях альтернатива состоит в том, чтобы достичь несколько меньшей степени очистки и получить двухкомпонентную культуру, содержащую всего лишь два вида микроорганизмов. Как уже отмечалось, использование двухкомпонентных культур — единственно возможный метод поддержания вирусов, так как это облигатные паразиты клеточных организмов. Облигатный внутриклеточный паразитизм характерен также для некоторых групп микроорганизмов, обладающих клеточной организацией. Во всех этих случаях двухкомпонентная культура — наилучший достижимый вариант культивирования в контролируемых лабораторных условиях.

Многих простейших, которые в природных условиях питаются более мелкими микроорганизмами, тоже проще всего поддерживать в лаборатории в виде двухкомпонентной культуры вместе с их меньшей по размерам жертвой. Так обстоит дело, например, с инфузориями, амебами и миксомицетами. Такие ассоциации, «по-видимому , никогда не бывают облигатными, так как тщательное изучение питания некоторых представителей этих групп показало, что их можно выращивать и в чистых культурах. Однако пищевые потребности простейших часто бывают крайне сложными, и поэтому приготовление сред для поддержания их чистых культур — дело трудное и кропотливое. Двухкомпонентные культуры вполне пригодны как для поддержания микроорганизмов, так и для многих экспериментальных целей.

Двухкомпонентную культуру получают в два этапа. Сначала необходимо получить чистую культуру питающего организма (хозяина в случае облигатных внутриклеточных паразитов или жертвы в случае простейших). Затем можно с помощью любого из многочисленных методов (высевая на чашки с твердой средой в присутствии питающего организма, производя разведения в жидкой среде или изолируя отдельные клетки) выделить паразита или хищника и ввести его в чистую культуру питающего организма.

Для успешного поддержания двухкомпонентных культур требуется значительное искусство, так как важно, чтобы сохранялось более или менее устойчивое биологическое равновесие между обоими компонентами. Используемая среда должна обеспечивать рост питающего организма, достаточный для удовлетворения потребностей паразита или хищника, но в то же время не должна быть слишком богатой, иначе развитие питающего организма может подавить рост ассоциированного с ним организма или привести к образованию вредных для него продуктов обмена.

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
SQL - 30 | 0,751 сек. | 8.72 МБ