Реакция бластной трансформации лимфоцитов (рбтл)

РБТЛ может проводиться с бактериальными, лекарственными, бытовыми, пыльцевыми аллергенами и с неспецифическим стимулятором фитогемагглютинином (ФГА).
Реактивы и оборудование: ФГА (венгерский препарат с исходной концентрацией 4 мг/мл, рабочее разведение 0,1 мл ФГА + 1,9 мл среды 199), среда 199 с добавлением 100 ЕД пенициллина и 50 ЕД стрептомицина на 1 мл среды, гепарин, краситель аэурэозин Романовского — Гимза, термостат, стерильный бокс, микроскоп, камера Горяева, предметные стекла, стерильная посуда (пробирки, пастеровские пипетки, пипетки на 1,0 и 5,0 мл, пенициллиновые флаконы и резиновые пробки), шприцы 1, 10, 20-граммовые.
Техника. В стерильную пробирку; смоченную гепарином (0,1 мл на 5 мл крови), вносят венозную кровь, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 40—50 минут. После оседания эритроцитов пастеровской пипеткой отсасывают плазму, содержащую лейкоциты, в стерильную пробирку. Отбирают 1 мл плазмы для постановки реакции. Подсчитывают число клеток в счетной камере Горяева (А), оставшуюся плазму освобождают от лейкоцитов центрифугированием (1000 об/мин) в течение 10 минут. Аутоплазму используют в дальнейшей работе для приготовления питательной среды (для культивирования клеток), разводя средой 199. Оптимальная концентрация клеток для постановки РБТЛ— 1:106 в 1 л. Для достижения данной концентрации 1 мл плазмы с известным количеством лейкоцитов (А) разводят до определенного объема (х) питательной средой х = А : 106 (в 1 л) — конечный объем смеси, в 1 л которого содержится 1 X 106 клеток. Разведенную в нужной концентрации клеточную взвесь разливают в стерильные пенициллиновые флаконы по З мл, добавляют по 0,1 мл ФГА (в рабочем разведении), плотно закрывают флаконы резиновой пробкой и культивируют клетки в термостате при 37° С в течение 3 суток. Через трос суток флаконы вынимают и сливают надосадочную жидкость, осадок на дне флакона тщательно смешивают с оставшимися несколькими каплями среды, продувая воздух через пастеровскую пипетку. Наносят каплю взвеси на предметное стекло, подсушивают на воздухе, фиксируют в метаноле 3 минуты и красят по методу Романовского — Гимза в течение 15 минут.
Оценка результатов. Просматривается 300—400 клеток, при этом подсчитывается количество бластов и бластоподобных переходных форм лимфоцитов. Подсчитывается количество трансформированных клеток в процентах к общему числу просчитанных клеток (у здоровых детей их количество составляет 60—70%).
Аналогично проводится РБТЛ с аллергенами: бактериальными — в концентрации 1 кожная доза в 0.1 мл, неинфекционными—1000 PNH в 1 мл, лекарственными веществами — 10 микрограмм в 1 мл. Реакция с ФГА служит в качестве контроля. При постановке РБТЛ с аллергенами количество трансформированных и переходных клеток составляет более 3%.

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
SQL - 52 | 0,450 сек. | 12.87 МБ