Приготовляя синтетические среды, микробиологи нередко сталкиваются с тем, что в процессе стерилизации выпадает осадок. Особенно часто это происходит, если среда содержит относительно высокие концентрации фосфатов. Осадок выпадает из-за того, что образуются нерастворимые комплексы фосфатов с некоторыми катионами, особенно с кальцием и железом. Обычно это не сказывается на питательной ценности среды, но осадок может затруднить наблюдение за развитием микробов или количественную оценку их роста. Образования осадка можно избежать , если отдельно стерилизовать концентрированные растворы солей кальция и железа, а затем добавлять их к уже простерилизованной и охлажденной среде. Эту трудность можно также обойти, добавив в среду небольшое количество вещества, которое образует с этими металлами растворимый комплекс (хелат) и предотвращает тем самым образование ими нерастворимого комплекса с фосфатами. Чаще всего для этого используют этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) в концентрации около 0,01%.
Поддержание аэробных условий
Для жизни облигатных аэробов необходим кислород. Аэробные микроорганизмы хорошо растут на поверхности агара на чашках или в тонком слое жидкой среды. В неперемешиваемых жидких культурах рост обычно происходит только у поверхности, а в глубине создаются анаэробные условия, и рост там невозможен. Поэтому для получения больших популяций в жидких культурах среду необходимо аэрировать . С этой целью в лабораториях используют различные устройства для встряхивания , которые аэрируют среду, непрерывно перемешивая ее. Применяют также другой способ аэрации, который состоит в том, что через культуру все время пропускают стерильную струю воздуха. Чтобы, увеличить поверхность контакта между газом и жидкостью, воздух можно подавать через пористый «разбрызгиватель», из которого он выходит очень мелкими пузырьками.
Методы культивирования облигатных анаэробов
Многие строго анаэробные микроорганизмы весьма чувствительны к молекулярному кислороду и быстро гибнут при контакте с ним. Поэтому соприкосновение таких культур с воздухом должно быть сведено к минимуму или даже полностью исключено . Кроме того, рост некоторых строгих анаэробов может начинаться только в средах с низким окислительно-восстановительным потенциалом (около 150 мВ или еще ниже). Поэтому при выращивании многих анаэробов нужно предварительно добавлять в культуральную среду какой-либо восстановитель, например цистеин, тиогликолевую кислоту, Na2S или аскорбат натрия. Приготовив такую среду, следует при ее хранении и использовании исключить доступ воздуха. Во время роста культуры для этого можно подавать в сосуд газ, не содержащий кислорода: С02 или N2.
Культуры строгих анаэробов в жидкой среде обычно выращивают в пробирках или колбах, доверху заполненных средой и закрытых резиновой пробкой или завинчивающейся пластмассовой крышкой. При использовании твердых сред можно избежать соприкосновения культур с воздухом несколькими способами. Организмы, способные переносить кратковременный контакт с воздухом, можно выделять методом посева штрихом на чашках, которые затем помещают в герметически закрывающиеся анаэробные эксикаторы. После этого удаляют кислород, для чего воздух откачивают и эксикатор заполняют каким-нибудь инертным газом (например, N2) или же помещают внутрь вещество, поглощающее О2. Иногда комбинируют оба эти способа удаления кислорода. Для выделения более чувствительных к кислороду анаэробов лучше применить метод разведения в агаре и сразу же после засева пробирки запечатать . В одной из модификаций этого метода используют вращающиеся пробирки, в которых расплавленный агар распределяется тонким слоем по стенкам. Пробирку заполняют газовой смесью, не содержащей кислорода, а затем закрывают резиновой пробкой.
Снабжение культур углекислотой
При культивировании фотоавтотрофов и хемоавтотрофов часто нужно бывает обеспечить клетки достаточным количеством углекислоты. Культура может расти за счет С02, поступающей в культуральную среду из воздуха путем диффузии, однако концентрация СО2 в атмосфере крайне низка (0,03% на открытом воздухе и лишь несколько выше в закрытых помещениях), поэтому для автотрофов углекислота нередко оказывается фактором, лимитирующим рост. Чтобы создать лучшие условия, культуру насыщают воздухом, искусственно обогащенным СО2 (до концентрации 1—5%) . По рассмотренным, выше причинам это усложняет задачу контроля pH, в связи с чем приходится видоизменять буферную систему среды. При культивировании автотрофов, способных расти в анаэробных условиях в закрытых сосудах (например, пурпурных и зеленых серобактерий) , потребность в С02 можно удовлетворить, добавив в среду NаНСОз. Растворимые карбонаты нельзя использовать в средах, находящихся в контакте с воздухом, так как быстрый выход СО2 в атмосферу ведет к сильному подщелачиванию среды.
Освещение
Для выращивания фототрофных микроорганизмов (водорослей, фотосинтезирующих бактерий) необходим свет. Обеспечить одновременно и достаточное освещение, и нужную температуру — задача довольно трудная. При культивировании нефотосинтезирующих организмов для поддержания надлежащей температуры используют термостаты . Однако большинство имеющихся в продаже термостатов не снабжено системой внутреннего освещения, и их нельзя использовать при выращивании фототрофных организмов.
Выставляя культуру на дневной свет, можно получить довольно плохо контролируемое и непостоянное освещение. При этом следует избегать прямого солнечного света, так как его интенсивность может оказаться чрезмерной и культура может настолько сильно нагреться, что ее рост окажется невозможным. Многие фототрофные микроорганизмы толерантны к постоянному освещению; в этих условиях они растут гораздо быстрее, поэтому выгоднее использовать искусственное освещение . При этом большое значение имеет спектральный состав света. В некоторых отношениях более удобны флуоресцентные лампы, так как они дают относительно мало тепла, что облегчает поддержание нужной температуры. Однако в длинноволновой области видимой части спектра и в ближней инфракрасной области излучение таких ламп слабее по сравнению с солнечным светом. Эти лампы можно применять при культивировании водорослей и цианобактерий, осуществляющих фотосинтез при длинах волн менее 700 нм, но они совсем не дают или дают очень мало света с длинами волн от 750 до 1000 нм, который необходим для фотосинтеза пурпурных и зеленых бактерий. Для этих групп фотосинтезирующих бактерий в качестве источников искусственного света приемлемы только лампы накаливания, так что если нужна высокая интенсивность освещения, то возникают трудности с отводом тепла. Проще всего в этом случае помещать сосуды с культурой в освещаемую сбоку стеклянную или пластмассовую водяную баню, температуру которой можно стабилизировать, создавая циркуляцию воды. Можно также помещать культуры вместе с лампами накаливания в бокс и поддерживать в нем надлежащую температуру с помощью вентиляции или холодильного устройства.