Так как размеры микроорганизмов очень малы, при изучении отдельных индивидуумов можно получить лишь ограниченную информацию об их свойствах. Поэтому обычно микробиологи изучают популяции, состоящие из миллионов и миллиардов особей. Такие популяции, или культуры, получают, выращивая микроорганизмы при более или менее определенных условиях. Культуру, содержащую микроорганизмы только одного вида, называют чистой, а культуру, в которой содержится более чем один вид микроорганизмов, — смешанной. Если же в культуре растут только два вида микроорганизмов, причем их специально поддерживают в ассоциации друг с другом, то такая культура называется двухкомпонентной.
Таким образом, основу микробиологических методов составляют две процедуры: выделение, т. е. изоляция определенного микроорганизма из существующих в природе смешанных популяций, и культивирование — выращивание микробной популяции в искусственной (культуральной) среде в лабораторных условиях. С каким бы видом ни работал микробиолог, он всегда будет использовать эти две процедуры. Они в принципе одинаковы при изучении вирусов, бактерий, грибов, водорослей, простейших и даже очень мелких беспозвоночных животных. Более того, в последние годы аналогичные методы стали применяться и при работе с линиями клеток или тканей высших растений и животных (культура ткани). Несмотря на все биологическое разнообразие организмов, с которыми имеет дело микробиология, ее единство как науки обусловлено именно тем, что в ней всегда используются эти основные методы.
Один и тот же штамм не может быть выделен второй раз из того же источника в другое время, потому что в любой популяции микроорганизмов генетическое разнообразие слишком велико, так же как и генетическая изменчивость микроорганизмов . Поэтому понятие «дикий штамм» означает все другие вариации клеток данного вида или любой другой штамм данного вида, но не вошедший в коллекцию микроорганизмов (то есть не имеющий описания и названия).
МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР
Микроорганизмы вездесущи, поэтому получение чистой культуры не сводится только к тому, чтобы выделить данный вид из смешанной природной популяции микробов: нужно еще поддерживать выделенный организм и его потомство в таких искусственных условиях, которые исключали бы загрязнение культуры другими видами. Для развития микроорганизмов не требуется много места; поэтому можно создать необходимые условия в пробирке, колбе или чашке Петри. Эти три типа сосудов наиболее широко используются для культивирования микроорганизмов. Культуральный сосуд сначала должен быть простерилизован (т. е. в нем должно быть уничтожено все живое), а затем, после того как в него будут внесены исследуемые микроорганизмы, защищен от загрязнения извне. Основной источник загрязнения — воздух, в котором всегда содержатся микроорганизмы. Крышка, накрывающая чашку Петри, специально предназначена для того, чтобы предотвращать попадание внутрь микробов из воздуха. Пробирки и колбы с той же целью затыкают пробками. Обычно для этого используют ватные пробки, хотя теперь часто применяют, особенно для пробирок, металлические колпачки или завинчивающиеся пластмассовые крышки.
Наружная поверхность культурального сосуда, конечно, тоже может служить источником загрязнения; когда колбу или пробирку открывают, чтобы внести в нее материал или взять пробу, внутрь могут попасть посторонние организмы. Чтобы этого избежать, сразу после того, как пробка вынута, и еще раз непосредственно перед закрыванием сосуда его горлышко обжигают в пламени.
Обычно инокулят (микробный материал, используемый для засева, или инокуляции, среды в культуральном сосуде) вносят на металлической проволочке или петле, которую перед самым использованием быстро стерилизуют в пламени. Жидкие культуры переносят также с помощью пипетки. Для этого тот ее конец, который берут в рот, затыкают ваткой, пипетку заворачивают в бумагу или помещают в стеклянный или металлический пенал и стерилизуют. Бумага или пенал предотвращает загрязнение как внутренней, так и внешней поверхности пипеток вплоть до их использования.
Чтобы еще больше снизить вероятность случайного загрязнения, можно пересевать культуры в настольном боксе или в небольшой закрытой комнате, куда поступает специально обработанный воздух, с пониженным содержанием микробов.
Выделение чистых культур путем высева на чашки
Чистые культуры микроорганизмов, образующих на твердых средах отдельные колонии (т. е. большинства бактерий, дрожжей, многих мицелиальных грибов и одноклеточных водорослей), проще всего выделять, используя одну из модификаций метода высева на чашки. Этот метод основан на том, что отдельные организмы иммобилизуются на поверхности или в глубине питательной среды, в которую добавлен агар или какое-нибудь другое гелеобразующее вещество. Рост каждого жизнеспособного организма приводит к образованию отдельной колонии, из которой легко сделать пересев на новую среду.
Обычно чаще всего для этой цели используют посев на чашки штрихом. Стерилизованную изогнутую проволочку окунают в разведенную надлежащим образом взвесь микроорганизмов и затем проводят ею ряд параллельных несоприкасающихся штрихов по поверхности уже застывшего слоя агара в чашке. При каждом последующем штрихе происходит постепенное разведение инокулята, так что даже если первые штрихи и дадут оплошной рост, то вдоль последующих штрихов вырастут обособленные колонии. Выделение можно проводить также и методом глубинного посева. Для этого последовательные разведения инокулята смешивают с расплавленной, но уже охлажденной агаризованной средой, а затем эти пробы выливают в стерильные чашки Петри, в которых они застывают, В результате колонии образуются в глубине агара.
Особые проблемы возникают при выделении методом высева на чашки строго анаэробных бактерий. Если контакт с кислородом не приводит сразу же к гибели исследуемых организмов, то можно производить посев в чашки как обычно, но затем инкубировать их в закрытых контейнерах, из которых путем химической абсорбции или сжигания горючего материала удален кислород. Для выделения более чувствительных к кислороду анаэробов лучше, однако, использовать модификацию метода глубинного посева, известную под названием культуры, разведенной размешиванием. В этом случае засевают пробирку с расплавленным и охлажденным агаром, содержимое пробирки перемешивают и примерно одну десятую его переносят в следующую пробирку с агаром. Содержимое этой пробирки также перемешивают и используют для засева третьей пробирки и так далее. После 6—10 последовательных разведений пробирки быстро охлаждают и запечатывают, нанося на поверхность слой стерильного вазелина и парафина, что препятствует проникновению воздуха в столбик агара. В таких культурах колонии вырастают внутри агара, и в результате их не так просто достать для переноса. Для этого удаляют с помощью стерильной иглы слой вазелина и парафина, а столбик агара осторожно выдувают из пробирки в стерильную чашку Петри, пропуская не содержащий кислорода газ через капиллярную пипетку, опущенную между стенкой пробирки и агаром. Чтобы можно было изучать и переносить колонии, столбик агара разрезают стерильным ножом на диски.
Если используется подходящая методика, то при выделении бактерий из смешанной природной популяции часто уже в первой серии чашек или культур, разведенных размешиванием, вырастают хорошо отделенные друг от друга колонии. Можно ли, взяв материал из такой колонии и засеяв им подходящую среду, считать, что получена чистая культура? Нередко так и поступают, однако выделенная культура может оказаться далеко не чистой. Микроорганизмы сильно различаются по своим потребностям, и поэтому не существует единой среды и единого комплекса условий , которые обеспечили бы рост всех имеющихся в природной популяции видов. Вероятно, лишь очень небольшая часть их окажется способной образовывать колонии на каждой дайной среде. Поэтому в первой чашке на каждую видимую колонию, возможно, будет приходиться тысяча клеток других микроорганизмов, которые тоже были нанесены на поверхность агара, но не дали макроскопически видимого роста, хотя они все еще могут быть жизнеспособными. Весьма вероятно, что некоторые из них также будут захвачены при переносе культуры. Для получения чистой культуры никогда не следует брать пробу с первой чашки. Суспензию клеток, полученную из отдельной колонии в первой чашке, следует рассеять штрихом в новую чашку. Если все колонии в этой второй чашке будут, по всей видимости, идентичными, то хорошо обособленную колонию можно уже будет использовать для получения чистой культуры.
Выделение чистой культуры анаэробных бактерий методом разведения . Показана вся серия пробирок с разведениями. В более плотно засеянных пробирках (справа) наблюдается сплошной рост, а в двух последних пробирках этой серии разведений (слева) видно хорошо отделенные друг от друга колонии. После того как агар застыл , каждую пробирку замазали смесью вазелина и парафина, чтобы воспрепятствовать проникновению атмосферного кислорода, подавляющего рост анаэробных бактерий. Среда с красным pH индикатором, при росте происходит закисление среды, и индикатор меняет свой цвет на желтый.
Не все микроорганизмы, способные расти на твердых средах, обязательно образуют отдельные колонии. Некоторые «бактерии, движущиеся при помощи жгутиков (например, Proteus и Pseudotnonas), могут быстро распространяться по слегка влажной поверхности свежеразлитой среды в чашке. Этого можно избежать, если использовать среды с хорошо подсушенной поверхностью, по которой клетки передвигаться не могут. Спирохеты и те организмы, которые перемещаются путем скольжения (миксобактерии, цианобактерии1) , могут двигаться по поверхности агарового геля или через него даже в том случае, если поверхность подсушена. Способность подобных организмов к передвижению помогает их очистке, так как они могут сами отделяться от других видов, иммобилизованных на агаре. Благодаря этому часто удается произвести очистку, позволяя клеткам передвигаться и делая повторные пересевы из передней кромки мигрирующей популяции.
Иногда при выделении организмов из природных популяций полезно включать в среду вещества, избирательно подавляющие рост тех или иных микробов. Особенно эффективны некоторые антибиотики ввиду их биологической специфичности. Бактерии сильно различаются по чувствительности к пенициллину; поэтому низкие концентрации его можно попользовать для подавления роста пенициллиночувствительных бактерий, присутствующих в исходной популяции. В более высоких концентрациях пенициллин обычно токсичен для прокариотических2, но не для эукариотических3 организмов. Поэтому он очень полезен для очистки культур простейших, грибов и эукариотических водорослей, загрязненных бактериями. Наоборот, прокариоты нечувствительны к полиеновым антибиотикам (например, к нистатину), которые обычно токсичны для эукариот. Добавление таких антибиотиков в среду иногда можно с успехом использовать для очистки бактериальных культур, сильно загрязненных грибами или амебами. Чтобы облегчить выделение микроорганизмов, можно использовать и многие другие вещества, обладающие избирательной токсичностью .