Техника накопительных культур — один из наиболее мощных методов, имеющихся в распоряжении микробиолога. Для выделения определенных микроорганизмов из природных источников можно использовать почти бесконечное множество комбинаций различных внешних факторов, как химических, так и физических. Методы обогащения позволяют по желанию выделять те или иные типы микробов, используя их специфические потребности. Эти методы можно безгранично варьировать с целью выделения и изучения не описанных ранее организмов, способных расти в условиях , созданных исследователем. Здесь мы попытаемся кратко описать ряд методов обогащения, которые могут быть использованы для выделения из природных источников основных физиологических групп микроорганизмов, главным образом бактерий.
Накопительные среды для хемогетеротрофов
Условия и питательные вещества, необходимые дли накопления в синтетической среде различных хемогетеротрофов, показаны на вкладке ниже, и далее в таблице приведен подробно состав каждой из таких сред.
Для накопления организмов, осуществляющих брожение, важна химическая природа органического субстрата. Чтобы субстрат мог сбраживаться, он не должен быть ни слишком окислен, ни слишком восстановлен. Прекрасными субстратами для брожения служат сахара, но сбраживаться могут и многие другие органические соединения примерно того же уровня окисленности. Инкубацию накопительных культур следует проводить в анаэробных условиях — не только потому, что некоторые организмы, получающие энергию в результате брожения, являются облигатными анаэробами, но и для того, чтобы предотвратить конкуренцию со стороны аэробных форм. В качестве источника азота нельзя использовать нитрат, так как в этом случае смогут расти и денитрифицирующие бактерии. Если накапливаемые организмы образуют кислоту, а сами к ней чувствительны, то можно добавить в среду углекислый кальций.
В синтетических средах при анаэробных условиях можно также проводить накопление трех особых физиологических групп хемогетеротрофных бактерий, для которых терминальными окислителями в дыхательном метаболизме вместо 02 служат другие неорганические соединения. В этих случаях не следует использовать такие легко сбраживаемые органические субстраты, как сахара. Для денитрифицирующих бактерий в качестве терминального окислителя в среду добавляют нитрат, а в качестве источника углерода и анергии — уксусную кислоту, масляную кислоту или этиловый спирт. Для сульфатредуцирующих бактерий добавляют относительно высокие концентрации сульфата, так как для них это специфический терминальный окислитель; лучшими источниками углерода и энергии служит молочная или яблочная кислота, но не уксусная. Для карбонат восстанавливающих (метанообразующих) бактерий в качестве окислителя необходима С02, а источником энергии и углерода может служить, например, муравьиная кислота7. Следует также отметить, что для накопления бактерий, восстанавливающих сульфаты и карбонаты, желательно использовать в качестве источника азота аммиак, так как добавление нитрата будет благоприятствовать развитию микроорганизмов, восстанавливающих нитраты. Для накопления бактерий, восстанавливающих карбонаты и нитраты, следует понизить до минимума концентрацию в среде сульфата, чтобы предотвратить усиленный рост сульфатредуцирующих бактерий.
Очевидно, что для накопления микроорганизмов, получающих энергию за счет аэробного дыхания, необходимы аэробные условия. Органическими питательными веществами в этом случае могут быть как сбраживаемые, так и несбраживаемые субстраты. Однако если используется сбраживаемый субстрат, то нужна обильная и постоянная аэрация культуры, так как истощение запасов кислорода в среде в результате дыхания благоприятствует накоплению анаэробов. Легко сбраживаемые соединения обычно стимулируют рост факультативных анаэробов. Поэтому при включении в накопительную среду глюкозы или какого-нибудь другого сахара, как в аэробных, так и в анаэробных условиях вырастают главным образом виды Enterobacter.
Использование несбраживаемых субстратов приводит обыкновенно к накоплению облигатных аэробов, чаще всего представителей рода Pseudomonas. Например, включая в качестве единственного органического вещества бензоат натрия (1 г/л) , можно получить окисляющие бензоат штаммы Pseudomonas putida. Если же единственным источником, как углерода, так и азота будет аспарагин (2 г/л) , то в культуре будут преобладать окисляющие аспарагин штаммы этого или родственных ему видов.
В синтетических средах для накопления аэробов в качестве источника азота обычно используют соли аммония. Если не добавлять соединений азота, то можно выделить культуры азотфиксирующих аэробных бактерий рода Azotobacter. Виды Azotobacter могут использовать в качестве единственного органического питательного вещества огромное множество различных субстратов, включая спирт, масляную и бензойную кислоты и глюкозу.
Накопительные среды хемоавтотрофных и фотосинтезирующих организмов
Для накопления хемоавтотрофных и фотоавтотрофных организмов из среды следует исключить органические соединения, а в качестве единственного источника углерода использовать С02 или бикарбонат.
Фотосинтезирующие формы нуждаются в свете, а культуры хемоавтотрофов нужно взращивать в темноте, чтобы предотвратить развитие фотосинтезирующих микроорганизмов . Во время инкубации культур необходимо поддерживать либо аэробные, либо анаэробные условия в зависимости от того, нуждаются ли данные организмы в кислороде. Исключение из этого правила составляют водоросли: так как они в процессе метаболизма сами выделяют кислород, то фактически все равно, будем ли мы инкубировать накопительные культуры водорослей в аэробных или в анаэробных условиях.
Среды, предназначенные для получения накопительных культур и выращивания фотосинтезирующих организмов, должны содержать натрий, так как известно, что этот элемент необходим для фотосинтезирующих бактерий.
Среда для накопления несерных пурпурных бактерий должна содержать подходящий органический субстрат, а иногда и бикарбонат. Этот субстрат не должен легко сбраживаться; обычно используют уксусную, масляную или яблочную кислоту. Если углерод в субстрате (как, например, в масляной кислоте) восстановлен в большей степени, чем в материале клетки, то нужно добавлять в среду бикарбонат , так как фотосинтез сопровождается потреблением С02. При использовании таких субстратов, как яблочная кислота, при метаболизме которых образуется С02, добавление бикарбоната не обязательно. Так как фотогетеротрофные бактерии нуждаются в различных факторах роста, то обычно в среду для их накопления добавляют небольшое количество дрожжевого экстракта.
Использование сложных сред
Накопительные культуры некоторых бактерий, обладающих крайне сложными потребностями в питательных веществах, получить в среде определенного состава невозможно. Тем не менее, иногда такие организмы можно выделить из природных источников, используя специально разработанные сложные среды. Примером могут служить молочнокислые бактерии. Для них характерна высокая устойчивость к молочной кислоте, которую они сами образуют при сбраживании сахара. Для накопления молочнокислых бактерий используют слабо забуференную среду, содержащую глюкозу и какой-нибудь богатый источник факторов роста (например, 20 г глюкозы и 10 г дрожжевого экстракта на 1 л среды). После инокуляции, которую желательно производить природным материалом, содержащим много молочнокислых бактерий (например, кусочками овощей, сырым молоком, сточными водами), проводят инкубацию при анаэробных условиях. Обычно сначала развиваются такие бактерии, как Enterobacter и Escherichia. Однако постепенно в среде накапливается молочная кислота, и условия становятся все менее и менее благоприятными для этих бактерий, тогда как молочнокислые бактерии продолжают расти. В конце концов, среда закисляется настолько, что начинают преобладать молочнокислые бактерии, а большинство других организмов погибает.
Еще один пример сложной среды, достаточно селективной для определенной группы организмов, — это среда, предназначенная для накопления пропионовокис-лых бактерий. Эти бактерии образуют при брожении пропионовую кислоту, уксусную кислоту и СО2. Хотя они легко сбраживают глюкозу, они не могут конкурировать в содержащей глюкозу среде ни с Enterobacter, ни с молочнокислыми бактериями, так как растут сравнительно медленно и не выносят кислых условий. Однако пропионовокислые бактерии могут также сбраживать и молочную кислоту, которая не является подходящим субстратом для большинства других организмов, осуществляющих брожение. Эту способность и используют для их накопления. С этой целью нейтральную среду, содержащую 20 г лактата натрия и 10 г дрожжевого экстракта на 1 л, засевают каким-нибудь природным материалом, содержащим пропионовокислые бактерии, и инкубируют при 30 °С в анаэробных условиях. Наилучшим инокулятом для получения таких культур служит швейцарский сыр, так как его созревание обусловлено в основном деятельностью пропионовокислых бактерий.
Сложные среды можно с успехом использовать и для селективного культивирования уксуснокислых бактерий. Эти бактерии хорошо приспособлены к среде с высокими концентрациями спирта. Кроме того, они менее других бактерий чувствительны к уксусной кислоте, которую они образуют из спирта при дыхании. Для их накопления сложную среду, содержащую спирт, инокулируют соответствующим материалом и инкубируют в аэробных условиях. Хорошими источниками инокулята могут быть плоды, цветки и непастеризованное (взятое прямо из бочки) пиво. Можно использовать среду, содержащую 40 мл спирта и 10 г дрожжевого экстракта на 1 л, с pH, доведенным до 6,0. Пиво и крепкий сидр также служат прекрасными накопительными средами, так как эти напитки близки к той природной среде, в которой хорошо растут уксуснокислые бактерии. Культура должна иметь большую поверхность контакта с воздухом, но инокулированную среду обычно сильно не аэрируют, так как многие уксуснокислые бактерии лучше всего растут в пленке, которую они образуют на поверхности.