Чтобы понять, насколько незаменим микроскоп в микробиологических исследованиях, нужно вспомнить об ограничениях, присущих глазу как оптическому прибору. Видимая величина объекта прямо пропорциональна углу, под которым этот предмет рассматривается. Значит, если расстояние от глаза до объекта уменьшится вдвое, то видимые размеры объекта увеличатся вдвое. Однако глаз человека не может сфокусироваться на предметах, находящихся от него на расстоянии меньше примерно 25 см. Это и есть то расстояние, на котором достигается максимальная разрешающая способность. Чтобы вообще можно было увидеть объект, его угловые размеры должны быть не менее 1′. При расстоянии в 25 см это соответствует частице величиной около 0,1 мм.
Большинство клеток (а значит, и большинство одноклеточных организмов) слишком малы, чтобы их можно было увидеть невооруженным глазом. Поэтому для того, чтобы обнаружить такие организмы и рассмотреть их форму и строение, необходим микроскоп. Назначение системы линз этого прибора, расположенных между объектом и глазом, состоит в том, чтобы увеличить кажущийся угол, под которым виден объект в поле микроскопа. Помимо увеличения, большое значение имеют также контрастность и разрешение. Чтобы объект можно было различить под микроскопом, необходима определенная степень контраста между этим объектом и окружающим фоном, а для получения четкого увеличенного изображения микроскоп должен обладать достаточной разрешающей способностью, которая позволяла бы раздельно воспринимать очень близкие точки изображения.
Световой микроскоп
Антони ван Левенгук открыл мир микробов, пользуясь простыми микроскопами с одной короткофокусной двояковыпуклой линзой. Для разработки используемых теперь сложных микроскопов и их усовершенствования потребовалось почти два века исследований по прикладной оптике.
В современном сложном микроскопе имеются три отдельные системы линз. Конденсор, расположенный между источником света и объектом, собирает лучи света в поле микроскопа.
Простым линзам присущи два оптических дефекта. Они неспособны сфокусировать одновременно все поле микроскопа (сферическая аберрация) и создают окрашенную кайму вокруг изображения (хроматическая аберрация). Эти дефекты можно почти полностью устранить, поместив рядом с основной линзой дополнительные корригирующие линзы. Поэтому и объектив, и окуляр современного сложного микроскопа составляют из нескольких линз, чтобы свести эти аберрации к минимуму.
Для получения четкого изображения очень важно правильно отрегулировать кон-денсорную линзу. При использовании больших увеличений необходимо установить конденсор так, чтобы обеспечить критическое освещение поля микроскопа: лучи света от источника должны фокусироваться в плоскости объекта, а световое поле должно занимать линзу объектива почти полностью.
Предел разрешающей способности
Максимальное полезное увеличение, достижимое с помощью светового микроскопа, определяется физическими свойствами света. Так как свет имеет волновую природу, очень малый объект будет виден в микроскоп как диск, окруженный рядом светлых и темных колец. Две соседние точки объекта можно «разрешить», т. е. они будут восприниматься раздельно, только в том случае, если эти окружающие их кольца не перекрываются. Пределом разрешения называется наименьшее расстояние между двумя точками, при котором их еще можно видеть раздельно. Именно этим расстоянием и определяется максимальное полезное увеличение светового микроскопа.
Величину предельного разрешения (d) дает уравнение d = 0,5A/nsinoc где X — длина волны используемого источника света, a — половина угла линзы объектива, т. е. угла между лучами, идущими от объекта к краям объектива, а п — показатель преломления среды между объектом (препаратом) и объективом. Знаменатель (nsina) , который обычно называют числовой апертурой (NA) , отражает свойства объектива. До некоторого предела разрешающая способность увеличивается с увеличением числовой апертуры. Если между препаратом и объективом находится воздух, то значение NA может достигать примерно 0,65 и лимитируется реально возможным диаметром линзы объектива. Значение N можно увеличить, если пространство между препаратом и объективом заполнить маслом, у которого показатель преломления значительно больше, чем у воздуха. Применяя иммерсионное масло и иммерсионные линзы, можно увеличить значение NA до 1,4, хотя обычно оно при этом достигает примерно 1,25. Если использовать видимый свет с наименьшей длиной волны (около 426 им), то при наилучших возможных условиях максимальное разрешение светового микроскопа приближается к 200 нм. Иными словами , с помощью светового микроскопа нельзя получить раздельные изображения двух точек, расстояние между которыми меньше 200 нм.
Контраст в световом микроскопе и его повышение
Мелкие живые биологические объекты, например клетки микробов, рассматривают под микроскопом обычно в тонком слое водной среды, заключенном между предметным и покровным стеклами. При этом видимость объекта обусловлена тем, что он пропускает света меньше, чем окружающая его среда, и в результате между объектом и средой создается некоторый контраст. Объект пропускает меньше света, во-первых, потому, что часть света поглощается клеткой, и во-вторых, потому, что часть его выводится из оптического пути микроскопа в результате различия в показателях преломления клетки и окружающей среды. Если не считать некоторых сильно окрашенных структур (каковы, например, хлоропласты), биологические объекты обычно очень слабо поглощают в видимой области спектра. Поэтому контраст живой клетки обусловлен почти исключительно преломлением света. Однако степень контраста можно сильно повысить, применив окрашивание. Обработка такими красителями, которые избирательно связываются, всей клеткой или определенными ее компонентами, приводит к значительно более сильному поглощению света. Большинство методов окрашивания вызывает гибель клеток, и поэтому перед окрашиванием клетки обычно фиксируют, т. е. проводят определенную их химическую обработку, чтобы по возможности уменьшить структурные изменения в клетках после их гибели. Обычно для этого применяют растворы, содержащие осмиевую кислоту и альдегиды, особенно часто глутаральдегид.
Микробные клетки чаще всего нет необходимости окрашивать, чтобы сделать их видимыми. Проще всего наблюдать микроорганизмы в живом состоянии, во влажном препарате, и для многих целей этого достаточно. Главная ценность окрашивания состоит в том, что оно дает возможность получать специфическую информацию о внутренней структуре клетки или ее химических свойствах. Например, специфическое окрашивание дезоксирибонуклеиновой кислоты позволяет выявить структуру и локализацию ядра. Много специальных методов окрашивания используется для получения данных о внутриклеточном отложении таких резервных материалов, как гликоген, полифосфаты и поли-р-оксимасляная кислота. Окраска по Граму и прочные кислые красители позволяют получать сведения о составе слоев клеточной стенки у бактерий. Иногда для выявления поверхностных слоев с очень низким показателем преломления, например слизи или капсул, часто окружающих клетки микробов, используют так называемые негативные красители, которые не проникают внутрь клетки. Такие слои можно выявить, добавив в среду, в которой суспендированы клетки, тушь. Содержащиеся в ней частицы угля не могут проникнуть через капсулу, и она выявляется в виде окружающей клетку светлой зоны.
Темнопольная микроскопия
При освещении небольшого объекта часть света рассеивается, и объект становится видимым как светящаяся точка на темном фоне. Это явление используется в методе темнопольного освещения, позволяющего выявлять такие объекты, которые слишком малы, чтобы их можно было увидеть при обычном освещении, или почему-либо не создают достаточного контраста. Такое освещение достигается с помощью специального конденсора, который фокусирует на препарате полый конус света, расходящиеся пучки которого не попадают в объектив. Через объектив проходит и создает изображение только тот свет, который рассеивается на объекте.
Подсветка образца в методе темнопольной микроскопии может осуществляться и в падающем свете. Изображение в этом случае создается светом, рассеивающимся на неоднородностях образца.
Фазово-контрастная микроскопия
Относительно слабый контраст при наблюдении живых клеток в обычный световой микроскоп можно значительно усилить, если использовать прибор с видоизмененной оптической системой — так называемый фазово-контрастный микроскоп. Система колец в конденсоре и объективе отделяет те лучи, которые дифрагировали (отклонились) на объекте, от тех, которые не дифрагировали . После того как дифрагировавшие лучи проходят через стеклянное кольцо (фазовую пластинку), вносящее дополнительный сдвиг по фазе, они рекомбинируются с теми лучами, которые не дифрагировали. С помощью такого видоизменения оптики можно резко повысить контраст клеток или внутриклеточных структур, очень мало отличающихся по показателю преломления от окружающей среды.
Ультрафиолетовая и флуоресцентная микроскопия
Так как разрешающая способность светового микроскопа находится в прямой зависимости от длины волны используемого света, можно несколько повысить разрешение (примерно вдвое), если освещать объект ультрафиолетовыми лучами. Для коротковолнового ультрафиолета стекло непрозрачно, поэтому линзы в таком микроскопе должны быть изготовлены из кварца; изображение приходится фотографировать, так как глаз ультрафиолетовых лучей не воспринимает. Из-за большой стоимости оборудования и его сложности ультрафиолетовая микроскопия находит лишь ограниченное применение. Однако ее модификация, так называемая флуоресцентная микроскопия, часто применяется для решения ряда важных биологических вопросов.
Некоторые химические соединения поглощают ультрафиолетовые лучи, по часть поглощенной энергии испускают в виде света с большими длинами волн, относящихся уже к видимой области спектра. Это явление называется флуоресценцией. Если облучать флуоресцирующий объект ультрафиолетом, то он будет ярко светиться на темном фоне. В этом и заключается принцип флуоресцентной микроскопии. Так как флуоресцирующий объект испускает видимый свет, который и проходит через микроскоп, то в этом случае из кварца должен быть изготовлен один лишь конденсор. В биологии флуоресцентная микроскопия используется в основном при методике иммунофлуоресценции. Если животное иммунизировать специфическим антигеном (например, какой-то определенной бактерией), то в его сыворотке будут содержаться антитела, специфически взаимодействующие с этим антигеном. Если к молекулам антител химически присоединить флуоресцирующий краситель, они приобретают способность интенсивно флуоресцировать; и когда такие антитела связываются со специфическим антигеном, весь этот комплекс оказывается флуоресцирующим. Поэтому с помощью флуоресцентной микроскопии можно специфически выявлять клетки определенного вида бактерий в смешанной популяции микробов , если эту популяцию обработать флуоресцирующей антисывороткой к данной бактерии. Этот метод использовали также при изучении роста клеточной стенки у бактерий).